CRISPR的全称Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats,意为成簇规律间隔短回文重复序列,Cas则是CRISPR-associated (Cas) systems。
CRISPR/Cas 系统是原核生物的免疫系统,这个系统可以识别出外源 DNA,并将它们切断,沉默外源基因的表达,用来抵抗外源遗传物质比如噬菌体病毒和外源质粒的入侵。这与真核生物中RNA干扰(RNAi)的原理是相似的。正是由于这种精确的靶向功能,CRISPR/Cas 系统被开发成一种高效的基因编辑工具。在自然界中,CRISPR/Cas系统拥有多种类别,其中 CRISPR/Cas9 系统是研究最深入,应用最成熟的一种类别。
CRISPR/Cas9 利用一段小 RNA 来识别并剪切 DNA 以降解外来核酸分子。现在使用的 CRISPR/cas 9 系统是由最简单的 type II CRISPR 改造而来,该系统由单链的 guide RNA 和有核酸内切酶活性的 Cas 9 蛋白构成。
⚠️nature video视频:CRISPR: 基因编辑原理及应用
人类基因组有两种方法进行断裂修复:NHEJ
(不需要模板,随机修复,出错率高,引起基因knock out) 和HDR
(需要模板,实现精准修复及knock in)。
Extended CRISPR techniques in recent years
基因敲除:sgRNA+Cas9
基因敲入:sgRNA+Cas9+目的基因(HDR模版)
5‘端开始数20个碱基这一段是需要设计的,这一段用来识别目的基因上的靶标,并通过碱基互补配对原理与靶点位置结合。
gRNA再往后数76个碱基,是另一段transactiviting RNA (tracrRNA)。它的序列是一定的,就像转运RNA一样可以形成空间结构,然后就可以和Cas9酶相结合。
这样一条完整的gRNA就可以识别靶点,并且把与它自身结合的Cas9酶带到这个靶点,引导Cas9酶在靶点处对目的基因的双链DNA进行切断,从而达到基因编辑的目的。
目前又很多在线工具可以用于设计sgRNA
不同的导入方式基因标记效率和脱靶效率不同
CRISPR-DO网站:根据crispr motif sequence的结果,对给定基因的locus上查找哪段motif可能是最有效的